急性毒性試驗(yàn)/重復(fù)給藥篩選試驗(yàn)

急性毒性評(píng)價(jià)是體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)的基本類型之一，藥品注冊(cè)往往需要進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)。急性毒性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)在安全性評(píng)價(jià)中有著特殊的作用，可以在最初的毒性描述中確定MTD或MFD。在這些試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)可以為安全藥理學(xué)試驗(yàn)以及重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的劑量選擇提供依據(jù)。急性毒性試驗(yàn)還可用于早期候選藥物的篩選，或者與簡單的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)同時(shí)運(yùn)用。應(yīng)注意的是，只有獲得了基于暴露途徑和臨床適應(yīng)癥的生物利用度和系統(tǒng)暴露的資料，才能為急性毒性研究提供有價(jià)值的信息。

（一）急性毒性（重復(fù)給藥篩選試驗(yàn)）
急性毒性試驗(yàn)可以有多種形式，但其主要目的是相同的，即測(cè)試所篩選的藥物在臨床劑量的若干倍數(shù)下能被耐受。篩選試驗(yàn)的好處在于可以在同一試驗(yàn)中同時(shí)比較幾個(gè)候選藥物。耐受性指標(biāo)[如體重和（或）飼料消耗的變化以及異常的臨床癥狀]可以為確定哪種候選藥物提供更好的參考依據(jù)。此時(shí)動(dòng)物品種的選擇一般不要求是全部動(dòng)物品種，但至少評(píng)價(jià)一種嚙齒類動(dòng)物。對(duì)于預(yù)定期每天服用的藥物，在5~7天的暴露周期內(nèi)對(duì)重復(fù)給藥進(jìn)行評(píng)價(jià)也是合理的。這有助于初步評(píng)價(jià)臨床病理學(xué)終點(diǎn)的潛在改變，并且對(duì)于其他毒性試驗(yàn)項(xiàng)目的劑量選擇也是有用的，但它不能替代急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行注冊(cè)申請(qǐng)?zhí)峤弧?br />

（二）急性毒性試驗(yàn)的基本設(shè)計(jì)包括每組動(dòng)物數(shù)量相對(duì)較少的數(shù)個(gè)劑量組。對(duì)于嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)，每個(gè)劑量組每個(gè)性別5只動(dòng)物是足夠的。第二種動(dòng)物品種一般使用2~3只動(dòng)物。應(yīng)設(shè)溶媒對(duì)照組至少3個(gè)供試品劑量組。劑量組也可以再增加，尤其是在進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)時(shí)對(duì)其毒理學(xué)概況知之甚少的情況下。在單次給予供試品后，體重、飼料消耗量和臨床觀察室獲悉毒理學(xué)作用的關(guān)鍵性數(shù)據(jù)。在給藥指定的天數(shù)后對(duì)存活動(dòng)物給予安樂死（通常是給藥后第14天）。大體解剖旨在對(duì)組織和器官的肉眼可見病變進(jìn)行評(píng)估。但在大多數(shù)情況下對(duì)這些組織不再做進(jìn)一步的組織病理學(xué)檢查。毒性評(píng)價(jià)一般僅限于觀察明顯的毒性反應(yīng)，如體重變化、飼料消耗量減少和（或）死亡、病態(tài)和供試品的藥理學(xué)左右等臨床觀察。急性毒性試驗(yàn)資料可為隨后的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供參考。

服務(wù)項(xiàng)目：

考察受試藥物對(duì)小鼠的 LD50 或最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）。
半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗(yàn)條件下引起 50%受試動(dòng)物死亡的劑量。該值是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得的結(jié)果。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受試動(dòng)物死亡的最高劑量。

服務(wù)內(nèi)容：

1、 小鼠急性毒性預(yù)試驗(yàn)，確定合理劑量設(shè)計(jì)
2、 可根據(jù)受試藥物特點(diǎn)選擇合適的給藥途徑，包括灌胃、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射等
3、 對(duì)部分可疑動(dòng)物進(jìn)行病理組織學(xué)檢查

客戶提供：受試樣品;

我們提交：詳細(xì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告;

服務(wù)周期：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案確定，請(qǐng)咨詢;

服務(wù)收費(fèi)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案確定，請(qǐng)咨詢;

服務(wù)特點(diǎn)：1.通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定給藥劑量及組間劑量比；2.不同給藥途徑滿足不同受試藥物測(cè)定需要。

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一、概述

動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)（Acute toxicity test，Single dose toxicity test），研究動(dòng)物一次或24小時(shí)內(nèi)多次給予受試物后，一定時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。擬用于人體的藥物通常需要進(jìn)行動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)處在藥物毒理研究的早期階段，對(duì)闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。急性毒性試驗(yàn)所獲得的信息對(duì)長期毒性試驗(yàn)劑量的設(shè)計(jì)和某些藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)起始劑量的選擇具有重要參考價(jià)值，并能提供一些與人類藥物過量急性中毒相關(guān)的信息。
急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)該在對(duì)受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問題具體分析”的原則。應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、適應(yīng)癥特點(diǎn)和試驗(yàn)?zāi)康牡冗x擇合理的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并結(jié)合其它藥理毒理研究信息對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。
急性毒性試驗(yàn)應(yīng)符合一般動(dòng)物試驗(yàn)的基本原則，即隨機(jī)、對(duì)照和重復(fù)。

二、基本概念

最大無毒性反應(yīng)劑量：即未見毒性反應(yīng)劑量（No observed adverse effect level,NOAEL），指受試物在一定時(shí)間內(nèi)，按一定方式與機(jī)體接觸，用靈敏的現(xiàn)代檢測(cè)方法和觀察指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)損害作用的最高劑量。
最小毒性反應(yīng)劑量：動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的最小劑量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受試動(dòng)物死亡的最高劑量。
最小致死劑量（Minimal lethal dose, MLD）：引起個(gè)別受試動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量。
半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗(yàn)條件下引起50%受試動(dòng)物死亡的劑量。該值是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得的結(jié)果。

三、研究內(nèi)容

（一）受試物
急性毒性試驗(yàn)的受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試驗(yàn)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報(bào)告。所用輔料、溶媒等應(yīng)標(biāo)明批號(hào)、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，并符合試驗(yàn)要求。
（二）動(dòng)物
1.種屬：不同種屬的動(dòng)物各有其特點(diǎn)，對(duì)同一藥物的反應(yīng)會(huì)有所不同。嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)所得的結(jié)果，無論是質(zhì)還是量上均會(huì)存在差別。從充分暴露受試物毒性的角度考慮，應(yīng)從嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物中獲得較為充分的安全性信息。因此，急性毒性試驗(yàn)應(yīng)采用至少兩種哺乳動(dòng)物。一般應(yīng)選用一種嚙齒類動(dòng)物加一種非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。若未采用非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，應(yīng)闡明其合理性。
2. 性別：通常采用兩種性別的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，雌雄各半。若采用單性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，則應(yīng)闡明其合理性。
3. 年齡：通常采用健康成年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。如果受試物擬用于兒童或可能用于兒童，建議必要時(shí)采用幼年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。
4. 動(dòng)物數(shù)：對(duì)于所用的動(dòng)物數(shù)，應(yīng)根據(jù)動(dòng)物的種屬和研究目的來確定。動(dòng)物數(shù)應(yīng)符合試驗(yàn)方法及其結(jié)果分析評(píng)價(jià)的需要。應(yīng)在獲得盡量多信息的前提下，使用盡量少的動(dòng)物數(shù)。
5. 體重：動(dòng)物初始體重不應(yīng)超過或低于平均體重的20%。
可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募笆茉囄锏奶攸c(diǎn)，確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別和年齡等。動(dòng)物應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定的等級(jí)要求，來源、品系、遺傳背景清楚，并具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證。
（三）給藥途徑
給藥途徑不同，受試物的吸收速度、吸收率和暴露量會(huì)有所不同，因此需要采用不同給藥途徑進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。另外，通過對(duì)不同途徑給藥所得結(jié)果進(jìn)行比較，可以獲得一些初步的生物利用度信息。通常，給藥途徑應(yīng)至少包括臨床擬用途徑和一種能使原形藥物較完全進(jìn)入循環(huán)的途徑（如靜脈注射）。如果臨床擬用途徑為靜脈給藥，則僅此一種途徑即可。經(jīng)口給藥前動(dòng)物一般應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間（通常一夜）的禁食，不禁水。因?yàn)槲竷?nèi)容物會(huì)影響受試物的給藥容量，而嚙齒類動(dòng)物禁食時(shí)間的長短會(huì)影響到藥物代謝酶的活性和受試物腸道內(nèi)吸收，從而影響毒性的暴露。
（四）給藥劑量水平
急性毒性試驗(yàn)的重點(diǎn)在于觀察動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)?？蛇x擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行急性毒性研究，對(duì)于非嚙齒類動(dòng)物給予出現(xiàn)明顯毒性的劑量即可，給藥劑量沒有必要達(dá)到致死水平。
總體上，給藥劑量應(yīng)從未見毒性劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性 (危及生命的) 劑量，同時(shí)設(shè)空白和/或溶媒（輔料）對(duì)照組。
不同動(dòng)物和給藥途徑下的最大給藥容量可參考相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)際情況來確定。
（五）觀察時(shí)間及指標(biāo)
給藥后，一般連續(xù)觀察至少14天，觀察的間隔和頻率應(yīng)適當(dāng)，以便能觀察到毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間及其恢復(fù)時(shí)間、動(dòng)物死亡時(shí)間等。觀察的指標(biāo)包括一般指標(biāo)（如動(dòng)物外觀、行為、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等）、動(dòng)物死亡情況（死亡時(shí)間、瀕死前反應(yīng)等）、動(dòng)物體重變化（給藥前、試驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物前各稱重一次，觀察期間可多次稱重）等。記錄所有的死亡情況、出現(xiàn)的癥狀，以及癥狀起始的時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間等。
（六）病理學(xué)檢查
所有的試驗(yàn)動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行大體解剖，包括試驗(yàn)過程中因?yàn)l死而處死的動(dòng)物、死亡的動(dòng)物以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的動(dòng)物。任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，均應(yīng)記錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

四、數(shù)據(jù)分析及評(píng)價(jià)

（一）結(jié)果處理和分析
1.根據(jù)所觀察到的各種反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間等，分析各種反應(yīng)在不同劑量時(shí)的發(fā)生率、嚴(yán)重程度。根據(jù)觀察結(jié)果歸納分析，判斷每種反應(yīng)的劑量－反應(yīng)及時(shí)間－反應(yīng)關(guān)系。
2. 判斷出現(xiàn)的各種反應(yīng)可能涉及的組織、器官或系統(tǒng)等。
3.根據(jù)大體解剖中肉眼可見的病變和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷可能的毒性靶器官。組織病理學(xué)檢查應(yīng)附有病理學(xué)檢查負(fù)責(zé)人簽名和藥品注冊(cè)申請(qǐng)人蓋章的報(bào)告及有病變組織的病理照片。
4.根據(jù)不同劑量組各種毒性反應(yīng)及發(fā)生率、動(dòng)物死亡情況等，確定動(dòng)物對(duì)受試物的無毒性反應(yīng)劑量和嚴(yán)重毒性反應(yīng)劑量。為此，建議采用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方法來測(cè)定最大無毒性反應(yīng)劑量或最小毒性反應(yīng)劑量，最大耐受劑量或近似致死量或最小致死劑量等，以初步判斷受試物的安全范圍。
5. 對(duì)于需要測(cè)定LD50的藥物，應(yīng)采用合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行求算。
6. 說明所使用的計(jì)算方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，提供所選用方法合理性的依據(jù)。
（二）綜合評(píng)價(jià)
根據(jù)各種反應(yīng)在不同劑量下出現(xiàn)的時(shí)間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系、不同種屬動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)室的歷史背景數(shù)據(jù)、病理學(xué)檢查的結(jié)果以及同類藥物的特點(diǎn)，判斷所出現(xiàn)的反應(yīng)與藥物作用的相關(guān)性?？偨Y(jié)受試物的安全范圍、出現(xiàn)毒性的嚴(yán)重程度及可恢復(fù)性；根據(jù)毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷毒性作用靶器官。
急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果可作為后續(xù)毒理研究劑量選擇的參考，也可提示一些后續(xù)毒性研究需要重點(diǎn)觀察的指標(biāo)。此外，根據(jù)不同途徑給藥時(shí)動(dòng)物的反應(yīng)情況，初步判斷受試物的生物利用度，為劑型開發(fā)提供參考。

五、急性毒性試驗(yàn)常用試驗(yàn)方法

由于受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性成分的含量各異，毒性反應(yīng)的強(qiáng)弱也不同，研究者應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)，選擇以下方法或國內(nèi)外公認(rèn)的試驗(yàn)方法。
1. 近似致死劑量法
該方法主要用于非嚙齒類的動(dòng)物試驗(yàn)。試驗(yàn)方法如下：
一般采用6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的年齡一般為4-6 月齡，猴的年齡一般為2-3 歲，選用其他動(dòng)物時(shí)應(yīng)說明理由。
根據(jù)小動(dòng)物的毒性試驗(yàn)結(jié)果、受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其它有關(guān)資料，估計(jì)可能引起毒性和死亡的劑量范圍。按50%遞增法，設(shè)計(jì)出含數(shù)個(gè)劑量的劑量序列表。
根據(jù)估計(jì)，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍，在此范圍內(nèi)，每間隔一個(gè)劑量給一只動(dòng)物，測(cè)出最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用二者之間的劑量給一只動(dòng)物。如果該劑量下動(dòng)物未發(fā)生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍；如果該劑量下動(dòng)物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。

2. 最大給藥量法
對(duì)于某些低毒的受試物可采用該方法。在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，以允許的最大劑量單次給藥或24 小時(shí)內(nèi)多次給藥(劑量一般不超過5g/kg 體重)，觀察動(dòng)物出現(xiàn)的反應(yīng)。一般使用10-20 只動(dòng)物，連續(xù)觀察14天。

3. 固定劑量法（Fixed-dose procedure）
該方法最初于1984 年由英國毒理學(xué)會(huì)提出，不以死亡作為觀察終點(diǎn)，而是以明顯的毒性體征作為終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
試驗(yàn)選擇5、50、500和2000mg/kg四個(gè)固定劑量進(jìn)行試驗(yàn)，特殊情況下可增加5000mg/kg劑量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首選大鼠，給藥前禁食6-12小時(shí)，給受試物后再禁食3-4小時(shí)。采用一次給藥的方式進(jìn)行。如無資料證明雄性動(dòng)物對(duì)受藥試物更敏感，首先用雌性動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試。根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述四個(gè)劑量中選擇一個(gè)作為初始劑量；若無有關(guān)資料可作參考時(shí)，可用500mg/kg作為初始劑量進(jìn)行預(yù)試，如無毒性反應(yīng)，則用2000mg/kg進(jìn)行預(yù)試，此劑量如無死亡發(fā)生即可結(jié)束預(yù)試。如初始劑量出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，即降低一個(gè)檔次的劑量進(jìn)行預(yù)試，如此時(shí)動(dòng)物存活，就在此兩個(gè)固定劑量之間選擇一個(gè)中間劑量試驗(yàn)。每個(gè)劑量給一只動(dòng)物，預(yù)試一般不超過5只動(dòng)物。每個(gè)劑量試驗(yàn)之間至少應(yīng)間隔24小時(shí)。給受試物后的觀察期至少7天，如動(dòng)物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。
在上述預(yù)試的基礎(chǔ)上進(jìn)行正式試驗(yàn)。每個(gè)劑量至少用10只動(dòng)物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，在上述四種劑量中選擇一個(gè)可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進(jìn)行試驗(yàn)，如預(yù)試結(jié)果表明，5.0mg/kg 引起死亡，則降低一個(gè)劑量檔次進(jìn)行試驗(yàn)。
給受試物后至少應(yīng)觀察2周，根據(jù)毒性反應(yīng)的具體特點(diǎn)可適當(dāng)延長。對(duì)每只動(dòng)物均應(yīng)仔細(xì)觀察并詳細(xì)記錄各種毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時(shí)間。給受試物當(dāng)天至少應(yīng)觀察記錄兩次，以后可每天一次。觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主活動(dòng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。動(dòng)物死亡時(shí)間的記錄要準(zhǔn)確。給予受試物前、后各1周、動(dòng)物死亡及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)稱取動(dòng)物的體重。所有動(dòng)物包括死亡或處死的動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行尸檢，尸檢異常的器官應(yīng)作組織病理學(xué)檢查。固定劑量試驗(yàn)法所獲得的結(jié)果，參考下表標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4. 上下法（階梯法，序貫法，Up and down method）
該方法由Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce又進(jìn)行了改進(jìn)，目前是OECD和EPA推薦的方法之一。其最大的特點(diǎn)是節(jié)省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)，不但可以進(jìn)行毒性表現(xiàn)的觀察，還可以估算LD50及其可信限，適合于能引起動(dòng)物快速死亡的藥物。該方法分為限度試驗(yàn)和主試驗(yàn)。限度試驗(yàn)主要用于有資料提示受試物毒性可能較小的情況?？梢詮呐c受試物相關(guān)的化合物或相似的混合物或產(chǎn)品中獲得相關(guān)毒性資料。在相關(guān)毒性資料很少或沒有時(shí)，或預(yù)期受試物有毒性時(shí)，應(yīng)進(jìn)行主試驗(yàn)。
限度試驗(yàn)：是最多用5 只動(dòng)物進(jìn)行的序列試驗(yàn)。試驗(yàn)劑量為2000 mg/kg，特殊情況下也可使用5000 mg/kg。
2000 mg/kg劑量水平的限度試驗(yàn): 將受試物給予1 只動(dòng)物。如果該動(dòng)物死亡，則進(jìn)行主試驗(yàn)；如果該動(dòng)物存活，依次將受試物給予另外4只動(dòng)物，動(dòng)物總數(shù)為5只。如果1 只動(dòng)物在試驗(yàn)后期死亡，而其他動(dòng)物存活，應(yīng)停止對(duì)其他動(dòng)物給藥，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行觀察，是否在相似的觀察期間也發(fā)生死亡。后期死亡的動(dòng)物應(yīng)與其他死亡的動(dòng)物同樣計(jì)數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行如下評(píng)價(jià): 有3 只或3 只以上動(dòng)物死亡時(shí)，LD50小于2000mg/kg；有3只或3只以上動(dòng)物存活時(shí)，LD50大于2000 mg/kg；如果有3 只動(dòng)物死亡，則進(jìn)行主試驗(yàn)。
5000mg/kg劑量水平的限度試驗(yàn):特殊情況下，可考慮使用5000mg/kg的劑量。將受試物給予1只動(dòng)物。如果該動(dòng)物死亡，則進(jìn)行主試驗(yàn)；如果該動(dòng)物存活，將受試物給予另外2只動(dòng)物。如果這2只動(dòng)物都存活，則LD50大于5000mg/kg，停止試驗(yàn)（即不再對(duì)其他動(dòng)物給藥，觀察14天）。如果這2只動(dòng)物中有1只死亡或者2只均死亡，將受試物給予另外2只動(dòng)物，一次1只。如果1只動(dòng)物在試驗(yàn)后期死亡，而其他動(dòng)物存活，應(yīng)停止對(duì)其他動(dòng)物給藥，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行觀察，是否在相似的觀察期間也發(fā)生死亡。后期死亡的動(dòng)物應(yīng)與其他死亡的動(dòng)物同樣計(jì)數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行如下評(píng)價(jià)。有3只或3 只以上動(dòng)物死亡時(shí)，LD50小于5000 mg/kg；有3 只或3 只以上動(dòng)物存活時(shí)，LD50大于5000 mg/kg。
主試驗(yàn):由一個(gè)設(shè)定的給藥程序組成，在此程序中，每次給藥1只動(dòng)物，間隔至少48小時(shí)。給藥間隔取決于毒性出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和毒性的嚴(yán)重程度。在確信前一只動(dòng)物給藥后能存活之前，應(yīng)推遲按下一劑量給藥。時(shí)間間隔可以適當(dāng)調(diào)整，但使用單一時(shí)間間隔時(shí)，試驗(yàn)會(huì)更簡便。
第一只動(dòng)物的給藥劑量低于LD50的最接近的估計(jì)值。如果該動(dòng)物存活，第二只動(dòng)物給予高一級(jí)劑量；如果第一只動(dòng)物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，第二只動(dòng)物給予低一級(jí)劑量。劑量級(jí)數(shù)因子應(yīng)選定為1/（劑量-反應(yīng)曲線斜率估計(jì)值）的反對(duì)數(shù)（對(duì)應(yīng)于斜率2的級(jí)數(shù)因子為3.2），并應(yīng)在整個(gè)試驗(yàn)過程中保持不變。當(dāng)沒有受試物的斜率的有關(guān)資料時(shí)，使用3.2為劑量級(jí)數(shù)因子。使用默認(rèn)級(jí)數(shù)因子時(shí)，劑量應(yīng)從以下序列中選擇：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求時(shí)1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。如果沒有受試物的致死估計(jì)值，應(yīng)該從175mg/kg開始。如果預(yù)期動(dòng)物對(duì)該受試物的耐受程度變化很大（即，估計(jì)斜率小于2.0），那么開始試驗(yàn)前應(yīng)考慮增加劑量級(jí)數(shù)因子超過按對(duì)數(shù)劑量計(jì)算的默認(rèn)值0.5（即，級(jí)數(shù)因子為3.2）。同樣，對(duì)于已知斜率很陡的受試物，應(yīng)選擇小于默認(rèn)值的級(jí)數(shù)因子。
在決定是否及如何對(duì)下一只動(dòng)物給藥之前，每只動(dòng)物都應(yīng)認(rèn)真觀察達(dá)48小時(shí)。當(dāng)滿足停止試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)，停止給藥，同時(shí)根據(jù)終止時(shí)所有動(dòng)物的狀態(tài)計(jì)算LD50估計(jì)值和可信區(qū)間。 用最大可能性法計(jì)算LD50值 (美國EPA開發(fā)了相應(yīng)的計(jì)算軟件，AOT425StatPgm)。
當(dāng)滿足下列停止試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)，停止試驗(yàn)：
（a） 連續(xù)3 只動(dòng)物存活；
（b） 任意連續(xù)6 只試驗(yàn)動(dòng)物中有5 只連續(xù)發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換；
（c） 第一只動(dòng)物發(fā)生轉(zhuǎn)換之后至少有4 只動(dòng)物進(jìn)入試驗(yàn)，并且其LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5 倍）。（首次轉(zhuǎn)換的第4 只動(dòng)物之后，對(duì)每次給藥進(jìn)行計(jì)算）。
對(duì)于LD50和斜率的各種組合，在動(dòng)物發(fā)生死亡/存活轉(zhuǎn)換之后，用4~6只動(dòng)物即可滿足停止試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（C）。但在一些情況下，化合物的劑量-反應(yīng)曲線的斜率較小，可能另外還需要增加動(dòng)物（總共可達(dá)15 只）。

5. 累積劑量設(shè)計(jì)法（金字塔法，Pyramiding dosage design）
在非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)可采用此方法。經(jīng)典的試驗(yàn)設(shè)計(jì)需要8 只動(dòng)物，分對(duì)照組和給藥組，每組4只動(dòng)物，雌雄各2只。
劑量的設(shè)計(jì)可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日給予下一個(gè)高劑量，劑量逐漸加大，直到出現(xiàn)動(dòng)物死亡時(shí)或達(dá)到劑量上限時(shí)為止。
當(dāng)沒有動(dòng)物死亡時(shí)，MLD（最小致死劑量）和LD50大于最高劑量或受限制劑量。當(dāng)在某一劑量所有動(dòng)物均出現(xiàn)死亡時(shí)，MLD和LD50應(yīng)在最后兩個(gè)劑量之間。當(dāng)在某一劑量部分動(dòng)物出現(xiàn)死亡，部分死亡出現(xiàn)在后繼的下一個(gè)高劑量，此時(shí)，MLD位于首次出現(xiàn)死亡的劑量和前一低劑量之間，LD50則應(yīng)在首次出現(xiàn)動(dòng)物死亡的劑量和所有動(dòng)物均死亡的劑量之間。假如沒有動(dòng)物死亡發(fā)生，常常以最高劑量給予動(dòng)物5-7 天，以確定后續(xù)的重復(fù)給藥試驗(yàn)中高劑量的選擇。

6. 半數(shù)致死量法
是一種經(jīng)典的急性毒性試驗(yàn)方法，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理可獲得受試物的LD50。