小核酸藥物相較于傳統(tǒng)的小分子化合物和抗體藥物，具有更高的靶向性和特異性，這使得它們能夠更有效地調(diào)控特定基因的表達(dá)，為治療各種疾病提供了新的途徑，在癌癥、遺傳性疾病以及病毒感染等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。然而，小核酸藥物的研究也面臨著一些重要挑戰(zhàn)。當(dāng)前，研究人員正致力于提高藥物的穩(wěn)定性，并優(yōu)化其靶向性，以期能夠更好地利用小核酸藥物的治療優(yōu)勢。

美迪西云講堂邀請在化學(xué)領(lǐng)域經(jīng)驗豐富的田寶泉博士，為大家解答小核酸藥物研發(fā)過程中的常見問題。并帶您把握前沿動態(tài),共同探討小核酸藥物的無限可能。

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01 您好，請問您認(rèn)為小核酸藥物研發(fā)目前的難點在哪里？

田寶泉博士：在小核酸藥物研發(fā)過程中，涉及多個關(guān)鍵步驟。首先是序列的篩選和優(yōu)化，設(shè)計小核酸藥物并不簡單，需要考慮其與非靶向基因的非特異性結(jié)合及可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)。由于許多mRNA具有不同的轉(zhuǎn)錄本，必須仔細(xì)研究其不同之處，以避免剪接時靶基因序列的漏失。因此，序列篩選通常需要進(jìn)行大規(guī)模篩選，以確保在靶基因的不同位點都有合適的候選化合物，這是一個技術(shù)難點。

其次是化學(xué)修飾，目前的化學(xué)修飾已能基本解決小核酸穩(wěn)定性的問題。然而，隨著臨床數(shù)據(jù)的積累，必須不斷發(fā)展化學(xué)修飾技術(shù)，以保持競爭力并避免被新一代藥物取代。另一個關(guān)鍵點是遞送系統(tǒng)，遞送系統(tǒng)的開發(fā)面臨著巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)，尤其是針對肝外靶向遞送系統(tǒng)的開發(fā)。目前適應(yīng)癥較為狹窄，為了促進(jìn)小核酸藥物的快速發(fā)展，必須擴(kuò)大其適應(yīng)癥范圍。

最后，小核酸藥物的藥效、藥代和毒理評估也是關(guān)鍵步驟。由于其特殊的性質(zhì)以及國內(nèi)并無上市的小核酸藥物，探索準(zhǔn)確評估小核酸藥物的安全性和有效性的評價方法同樣具有挑戰(zhàn)性。此外，后續(xù)生產(chǎn)工藝的后期放大和成本控制也是小核酸藥物研發(fā)中不可忽視的難題。

在國內(nèi)，小核酸藥物的研發(fā)正處于初步階段，建立高效安全的評估體系尤為重要。這些問題都需要科研人員一一關(guān)注和不斷的完善和解決。

02 糖環(huán)并四元環(huán)的核苷酸單體有在臨床應(yīng)用嗎？是否只有臨床前研究？個人覺得這個類型的核苷單體成本太高，是否不太具備性價比？

田寶泉博士：目前已有文獻(xiàn)報道糖環(huán)并四元環(huán)的存在。在臨床應(yīng)用方面，有關(guān)于5’糖環(huán)并四元環(huán)破5‘-（E）-VP的專利，確實有一些已經(jīng)應(yīng)用于臨床。然而，目前僅有這些例子，糖環(huán)并四元環(huán)在核糖本身的，在臨床上尚未應(yīng)用。在小核酸藥物中，核糖成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的鎖核酸在ASO藥物中確實有應(yīng)用，例如采用gapmer結(jié)構(gòu)的ASO藥物中使用到了鎖核酸的單體。、

關(guān)于價格高的問題確實存在，但是隨著產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，成本的問題是能夠解決的，例如我們在研發(fā)過程中，起初幾千元一克的單體化合物已降至現(xiàn)在的約300元一克，工藝研發(fā)部門正在努力進(jìn)一步降低成本。新型的核苷酸單體一旦開發(fā)成功，根據(jù)小核酸研發(fā)的平臺優(yōu)勢作用，可在多個管線應(yīng)用，成本相對分?jǐn)偤髮⒉辉偈侵饕獑栴}。在新藥開發(fā)中，化學(xué)修飾的選擇至關(guān)重要，雖然核酸單體的開發(fā)成本需謹(jǐn)慎考慮，但技術(shù)和平臺的進(jìn)步使得化學(xué)修飾成為可行的選項。

03 單體的純度對寡核苷酸合成純度的影響？

田寶泉博士：確實是有影響，在我們的前期篩選階段，通常對純度的要求并不十分嚴(yán)格，有時候即使是95%的純度也能夠接受，98%的也是可以。然而，當(dāng)進(jìn)入后期工藝放大階段時，即便是99%的純度，如果單體中單雜含量超過了0.5%，會對后續(xù)純化工藝造成顯著的成本增加。因此，在單體質(zhì)量控制方面，尤其是在工藝研發(fā)階段，嚴(yán)格控制質(zhì)量是必不可少的。

04 最近酶法合成寡核苷酸技術(shù)有所突破，對固相合成有影響？

田寶泉博士：是的，近期在寡核苷酸合成領(lǐng)域，酶法技術(shù)取得了顯著進(jìn)展。Alnylam等公司一直在推動酶法的固相合成方法，我參考的專利顯示，不同于一次性合成，他們采用分段的方法，先將幾個單體用固相法合成，再利用酶法特異性連接起來。酶法合成技術(shù)是否繼續(xù)發(fā)展尚不得而知，但它已經(jīng)可以與傳統(tǒng)固相合成技術(shù)相比擬。在小規(guī)模合成中，酶法與固相合成技術(shù)表現(xiàn)相當(dāng)，但要實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，目前仍主要依賴固相合成。

當(dāng)然，未來酶法技術(shù)的發(fā)展?jié)摿薮?。兩三年前，也有人問起酶法合成小核酸藥物的可行性，那個時候確實只有固相合成這一個途徑，而現(xiàn)在情況可能已有所不同。

05 初篩序列的時候是否需要進(jìn)行修飾？

田寶泉博士：初篩的時候不需要修飾，在研發(fā)過程中，初始篩選階段通常使用未修飾的裸序列。修飾通常在確認(rèn)敲低率良好的序列后進(jìn)行，因為若修飾方法不當(dāng)，可能會導(dǎo)致敲除率嚴(yán)重下降。因此，我們不會在未經(jīng)篩選的序列上直接進(jìn)行修飾，以免增加其篩選失敗的風(fēng)險。

如果擔(dān)心序列的穩(wěn)定性問題，可以選擇例如在3’端添加dTdT以增加其穩(wěn)定性。通常情況下凍干粉形式的裸序列可以保持?jǐn)?shù)月，而溶液狀態(tài)下保持?jǐn)?shù)周，其生物藥效也不會產(chǎn)生大的改變。因此，在初期篩選階段通常無需進(jìn)行修飾，可以直接用裸序列進(jìn)行篩選工作。

06 序列一開始就進(jìn)行修飾設(shè)計的，和裸序列設(shè)計篩選后在修飾，哪一種更推薦？

田寶泉博士：建議首先進(jìn)行裸序列的篩選。即使裸序列篩選工作良好，如果后續(xù)的修飾方法不當(dāng)，體外往往無法表現(xiàn)出預(yù)期的效果，這種情況在實踐中非常多見。因此，推薦先對裸序列進(jìn)行篩選，然后再考慮進(jìn)行修飾。首先確定一個優(yōu)秀的裸序列，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不同的修飾，以驗證哪種修飾方法能夠保持其活性。

07 固相合成PS轉(zhuǎn)PO高怎么辦？

田寶泉博士：按照我的理解，在固相合成的時候，對于磷硫?；磻?yīng)后，確實會有磷?；摹SO藥物通常全部使用硫代是比較安全的，而siRNA藥物則僅在鏈端使用硫代基團(tuán)。在鏈端個別磷酸硫代完后還要多次做磷?；驗闊o論是硫代還是磷?；磻?yīng)，都從亞磷酰胺轉(zhuǎn)化而來，而亞磷酰胺非?；钴S。在磷?；^程中，很容易發(fā)生硫代被氧化，這可能導(dǎo)致硫代磷?；膯误w重新被氧化成磷酸。因為磷酸是通過碘氧化來引入的，這個過程中，需要精確控制氧化劑在固相柱上的停留時間，以確保反應(yīng)迅速進(jìn)行。如果控制不當(dāng)，可能會導(dǎo)致硫代磷酸再次轉(zhuǎn)化為磷酸。

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